1高效液相色谱仪的系统组成、工作原理
高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成
储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相)内,由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数,在两相中作相对运动时,经过反复
次的吸附-解吸的分配过程,各组分在移动速度上产生较
的差别,被分离成单
组分依次从柱内流出,通过检测器时,样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。
2高效液相色谱仪的应用
高效液相色谱法要求样品能制成溶液,不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的
类繁多,因而可以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。与试样预处理技术相配合,HPL C所达到的高分辨率和高灵敏度,使分离和同时测定性质上十分相近的物质成
可能,能够分离复杂相体中的微量成分。随着固定相的发展,有可能在充分保持生化物质活性的条件下完成其分离。HPL C成为解决生化分析问题最有
途的方法。由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用,流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是
个重要的发展方向。液相色谱-质谱连用技术受到普遍重视,如分析氨基甲酸酯农药和多核芳烃等;液相色谱-红外光谱连用也发展很快,如在环境污染分析测定水中的烃类,海水中的不挥发烃类,使环境污染分析得到新的发展。
3高效液相色谱仪常见故障处理
L C - 10A T高效液相色谱仪是日本岛津公司1996年的产品,检测器为可变波长紫外检测器,色谱柱为岛津公司的ODS - C18 ,大连依利特的ODS - C18。八年的日常工作中遇到了几种故障,如故障1经咨询岛津公司的工程师后,得以解决;故障2、故障5是频繁碰到的问题等,特作总结如下:
故障1流动相内有气泡,关闭泵,打开泄压阀,打开p urge键,清洗脱气,气泡不断从过滤器冒出,进入流动相,无论打开p urge键几次,都无法清除不断产生的气泡。
原因过滤器长期沉浸于乙酸铵等缓冲液内,过滤器内部由于霉菌的生长繁殖,形成菌团,阻塞了过滤器,缓冲液难以流畅地通过过滤器,空气在泵的压力作用下经过滤器进入流动相。
处理过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,超声清洗几分钟即可;亦可将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中12～36小时,轻轻震荡几次,再将过滤器用纯水清洗几次,打开泄压阀,打开p urge键,清洗脱气,如仍有气泡不断从过滤器冒出,继续将过滤器浸泡于5 %硝酸溶液中,如没有气泡不断从过滤器中冒出,说明过滤器内部的霉菌菌团已被硝酸破坏,流动相可以流畅地通过过滤器。打开泄压阀,打开泵,流速调至1. 0～3. 0ml/ min ,纯水冲洗过滤器1小时左右。即可将过滤器清洗干净。关闭泄压阀,纯甲冲洗半小时即可。
故障2柱压高原因(1)缓冲液盐分如(乙酸铵等)沉积于柱内; (2)样品污染沉积。
处理对于第一种情况先用40～50 ℃的纯水,低速正向冲洗柱子,待柱压逐渐下降后,相应提高流速冲洗,柱压大幅度下降后,用常温纯水冲洗,之后用纯甲醇冲洗柱子30分钟;对于第二种情况,由样品的沉积引起污染的C18柱,和纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4 + 6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) ,再用换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。
故障3既无压力指示,又无液体流过[1 >。
原因(1)泵密封垫圈磨损; (2)大量气泡进入泵体。
处理对于第一种情况,
换密封垫圈;对于第二种情况,在泵作用的同时,用一个50ml的玻璃针筒在泵的出口处帮助抽出空气。
故障4压力波动大,流量不稳定[1 >。
原因系统中有空气或者单向阀的宝石球和阀座之间夹有异物,使得两者不能密封。
处理工作中注意观察流动相的量,保证不锈钢滤器沉入储液器瓶底,避免吸入空气,流动相要充分脱气[2 >。如为单向阀和阀座之间夹有异物,拆下单向阀,放入盛有丙酮的烧杯用超声波清洗.
故障5出峰不佳,峰分叉。
原因(1)色谱柱被污染; (2)柱头填料塌陷。
处理对于第一种情况,先用纯水反向冲洗柱子,然后换成甲醇冲洗,接着用甲醇+异丙醇(4 + 6)冲洗柱子(冲洗时间的长短由样品污染的情况而定) ,再换成甲醇冲洗,然后用纯水冲洗,最后甲醇冲洗正向冲洗柱子30分钟以上。如冲洗后依然出峰不佳,则考虑第二种情况。对于第二种情况,拧开柱头,检查柱填料是否硬结或塌陷。去除硬结部分(污染的填料) ,装入新填料,滴一滴甲醇,填料下陷,再填,用与柱内径相同的顶端平滑的不锈钢杆压紧,再填平,滴甲醇,再压紧反复几次,直至装满填平[2 >。柱头用甲醇冲洗干净,擦净柱外壁的填料,拧紧柱头,用纯甲醇冲洗30分钟以上。
故障6峰面积重复性不佳。
原因(1)进样阀漏液; (2)加样针不到位。
处理对于第一种情况更换进样阀垫圈;对于第二种情况保证加样针插到底,注射样品溶液后须快速、平稳地从LOAD状态转换到INJ EC T状态,以保证进样量的准确。日常工作中,液相色谱仪的保养非常重要,如要注意不要让空气进入输液系统和高压泵中,储液器内的溶液如长时间未用应清洗储液器并更换溶液,每次用完色谱仪后缓冲液要用纯水冲洗干净,防止无机盐析出或沉积;样品的前处理也很重要,任何样品都要尽可能地去除杂质,完全溶解,尽量减少对色谱柱的污染,以延长色谱柱的使用寿命,同时避免注射过浓的样品溶液,以免残留液在进样阀内析出固体引起堵塞;色谱柱作好标记,用于不同分析目的的色谱柱不要混用等。
